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中华人民共和国国家环境保护标准HJ1001-2018
添加时间:2019-02-14
  水质总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的测定酶底物法
Water quality—Determination of total coliforms, fecal coliforms and Escherichia coli—Enzyme substrate method
生 态 环 境 部 发 布
前言
1 适用范围
2规范性引用文件
3术语和定义
4方法原理
5干扰和消除
6试剂和材料
7仪器和设备
8 样品
9分析步骤
10结果计算与表示
11精密度和准确度
12 质量保证和质量控制
13废弃物处理
附录 A(资料性附录)结果判定参考图片
附录 B(规范性附录)97 孔定量盘法 MPN 表
附录 C(资料性附录)97 孔定量盘法 MPN 表对应 95%置信区间
前 言
为贯彻《中华人民共和国环境保护法》和《中华人民共和国水污染防治法》,保护生态
环境,保障人体健康,规范水中总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的测定方法,制定
本标准。
本标准规定了测定地表水、地下水、生活污水和工业废水中总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的酶底物法。
本标准的附录A为规范性附录,附录B和附录C为资料性附录。
本标准为首次发布。
本标准由生态环境部生态环境监测司、法规与标准司组织制订。
本标准起草单位:上海市环境监测中心。
本标准验证单位江苏省环境监测中心、浙江省环境监测中心、常州市环境监测中心、上海市松江区环境监测站、上海市长宁区环境监测站和上海市青浦区环境监测站。
本标准生态环境部2018年12月26日批准。
本标准自2019年6月1日起实施。
本标准由生态环境部解释。
1水质总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的测定 酶底物法
1 适用范围
本标准规定了测定水中总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的酶底物法。
本标准适用于地表水、地下水、生活污水和工业废水中总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的测定。
本方法的检出限为 10 MPN/L。
2 规范性引用文件
本标准引用了下列文件或其中的条款。凡是不注日期的引用文件,其有效版本适用于本标准。
GB/T 6682 分析实验用水规格和实验方法
GB/T 14581 水质 湖泊和水库采样技术指导
HJ 494 水质 采样技术指导
HJ/T 91 地表水和污水监测技术规范
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。
3.1
总大肠菌群 total coliforms37℃培养 24 h,能产生β-半乳糖苷酶(β-D-galactosidase),分解选择性培养基中的邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)生成黄色的邻硝基苯酚的肠杆菌科细菌。
3.2
粪大肠菌群 fecal coliforms又称耐热大肠菌群(thermotolerant coliforms)。44.5℃培养 24 h,能产生β-半乳糖苷酶(β-D-galactosidase),分解选择性培养基中的邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)生成黄色的邻硝基苯酚的肠杆菌科细菌。
3.3
大肠埃希氏菌 Escherichia coli俗称大肠杆菌。37℃培养 24 h,能产生β-半乳糖苷酶(β-D-galactosidase),分解选择性培养基中的邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)生成黄色的邻硝基苯酚,同时产生β-葡萄糖醛酸酶(β-Glucuronidase),分解选择性培养基中的 4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷2(MUG)释放出荧光物质(4-甲基伞形酮)的肠杆菌科细菌。
3.4
最大可能数 most probable number(MPN)又称稀释培养计数,是一种基于泊松分布的间接计数法。利用统计学原理,根据一定体积不同稀释度样品经培养后产生的目标微生物阳性数,查表估算一定体积样品中目标微生物存在的数量(单位体积存在目标微生物的最大可能数)。
4 方法原理
在特定温度下培养特定的时间,总大肠菌群、粪大肠菌群、大肠埃希氏菌能产生β-半乳糖苷酶,将选择性培养基中的无色底物邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)分解为黄色的邻硝基苯酚(ONP);大肠埃希氏菌同时又能产生β-葡萄糖醛酸酶,将选择性培养基中的 4- 甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷(MUG)分解为 4-甲基伞形酮,在紫外灯照射下产生荧光。
统计阳性反应出现数量,查 MPN 表,分别计算样品中总大肠菌群、粪大肠菌群、大肠埃希氏菌的浓度值。
5 干扰和消除
5.1 活性氯具有氧化性,能破坏微生物细胞内的酶活性,导致细胞死亡,可在样品采集(8.1)
时加入硫代硫酸钠溶液(6.4)消除干扰。
5.2 重金属离子具有细胞毒性,能破坏微生物细胞内的酶活性,导致细胞死亡,可在样品采集(8.1)时加入乙二胺四乙酸二钠溶液(6.5)消除干扰。
6 试剂和材料
除非另有说明,分析时均使用符合国家标准的分析纯试剂,实验用水应满足 GB/T 6682中三级水的要求。
6.1 培养基。
本标准采用 Minimal Medium ONPG-MUG 培养基。每 100 ml 样品需使用培养基粉末
2.7 g±0.5 g,所含基本成分如下:
硫酸铵[(NH4)2SO4] 0.5 g
硫酸锰(MnSO4) 0.05 mg
硫酸锌(ZnSO4) 0.05 mg
硫酸镁(MgSO4) 10 mg
氯化钠(NaCl) 1 g
氯化钙(CaCl2) 5 mg
亚硫酸钠(Na2SO3) 4 mg
两性霉素 B(Amphotericin B) 0.1 mg
邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG) 50 mg
4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷(MUG) 7.5 mg
茄属植物萃取物(Solanium 萃取物) 50 mg
N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸钠盐(HEPES 钠盐) 0.53 g
N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸(HEPES) 0.69 g
也可采用市售商品化培养基制品。
6.2 硫代硫酸钠(Na2S2O3·5H2O)。
6.3 乙二胺四乙酸二钠(C10H14N2O8Na2·2H2O)。
6.4 硫代硫酸钠溶液:ρ(Na2S2O3)=0.10 g/ml。
称取 15.7 g 硫代硫酸钠(6.2),溶于适量水中,定容至 100 ml,临用现配。
6.5 乙二胺四乙酸二钠溶液:ρ(C10H14N2O8Na2·2H2O)=0.15 g/ml。
称取 15 g 乙二胺四乙酸二钠(6.3),溶于适量水中,定容至 100 ml,此溶液保质期为30 d。
6.6 97 孔定量盘:含 49 个大孔,48 个小孔。其中,每个小孔可容纳 0.186 ml 样品,大孔中 48 个大孔每个可容纳 1.86 ml 样品,一个顶部大孔可容纳 11 ml 样品。也可采用经环氧乙烷灭菌的市售商品化成品。
6.7 标准阳性比色盘。
6.8 无菌水:取适量实验用水,经 121℃高压蒸汽灭菌 20 min,备用。
7 仪器和设备
7.1 采样瓶:具螺旋帽或磨口塞的 100 ml、250 ml、500 ml 广口玻璃瓶。
注:在采集不存在或不考虑余氧、金属离子干扰的样品时,可采用市售无菌采样瓶或无菌采样袋。
7.2 高压蒸汽灭菌器:121℃可调。
7.3 恒温培养箱:允许温度偏差 37℃±1℃、44.5℃±0.5℃。
7.4 程控定量封口机:用于 97 孔定量盘(6.6)的封口。
7.5 紫外灯:365~366 nm。
7.6 移液管:1 ml±0.01 ml、10 ml±0.1 ml。也可采用计量合格的可调式移液器。
7.7 三角瓶:100 ml。
7.8 量筒:100 ml±1 ml。
7.9 一般实验室常用仪器和设备。
注:三角瓶、移液管、采样瓶等玻璃器皿及采样器具要在试验前按无菌操作要求包扎,121℃高压蒸汽灭菌 20 min,烘干,备用。
8 样品
8.1 样品采集
点位布设及采样频次按照 GB/T 14581、HJ/T 494 和 HJ/T 91 的相关规定执行。
采集微生物样品时,采样瓶(7.1)不得用样品洗涤,采集样品于灭菌的采样瓶中。
采集河流、湖库等地表水样品时,可握住瓶子下部直接将带塞采样瓶插入水中,约距水面 10~15 cm 处,瓶口朝水流方向,拔瓶塞,使样品灌入瓶内然后盖上瓶塞,将采样瓶从水中取出。如果没有水流,可握住瓶子水平往前推。采样量一般为采样瓶容量的 80%左右。样品采集完毕后,迅速扎上无菌包装纸。
从龙头装置采集样品时,不要选用漏水龙头,采水前将龙头打开至最大,放水 3~5 min,然后将龙头关闭,用火焰灼烧约 3 min 灭菌或用 70%~75%的酒精对龙头进行消毒,开足龙头,再放水 1 min,以充分除去水管中的滞留杂质。采样时控制水流速度,小心接入瓶内。
采集地表水、废水样品及一定深度的样品时,也可使用灭菌过的专用采样装置采样。
在同一采样点进行分层采样时,应自上而下进行,以免不同层次的搅扰。
如果采集的是含有活性氯的样品,需在采样瓶灭菌前加入硫代硫酸钠溶液(6.4),以除去活性氯对细菌的抑制作用(每 125 ml 容积加入 0.1 ml 的硫代硫酸钠溶液);如果采集的是重金属离子含量较高的样品,则在采样瓶灭菌前加入乙二胺四乙酸二钠溶液(6.5),以消除干扰(每 125 ml 容积加入 0.3 ml 的乙二胺四乙酸二钠溶液)。
注:15.7 mg 硫代硫酸钠(6.2)可去除样品中 1.5 mg 活性氯,硫代硫酸钠用量可根据样品实际活性氯量调整。
8.2 样品保存
采样后应在 2 h 内检测,否则,应 10℃以下冷藏但不得超过 6 h。实验室接样后,不能立即开展检测的,将样品于 4℃以下冷藏并在 2 h 内检测。
9 分析步骤
9.1 样品稀释
根据样品污染程度确定接种量(见表 1),避免接种样品培养后 97 孔定量盘(6.6)出现全部阳性或全部阴性。接种量小于 100 ml 时,应稀释样品后接种,接种量为 10 ml 时,
取 10 ml 样品加入到盛有 90 ml 无菌水(6.8)的三角瓶(7.7)中混匀制成 1:10 的稀释样品,其他接种量的稀释样品依次类推。对于未知样品,可选用多个接种量进行检测。
表 1 样品接种量参考表
样品类型 接种量(ml)
 
102
 
10
 
1 0.1 10–2
地表水 水源水  ▲        
湖泊(水库)  ▲        
河流  ▲  ▲  ▲    
废水 生活污水  ▲  ▲  ▲  ▲  
工业废水 处理前    ▲  ▲  ▲  ▲
处理后  ▲        
地下水  ▲        
 
9.2 接种
量取 100 ml 样品或稀释样品于灭菌后的三角瓶,加入 2.7 g±0.5 g 培养基(6.1)粉末,充分混匀,完全溶解后,全部倒入 97 孔定量盘(6.6)内,以手抚平 97 孔定量盘背面,赶除孔内气泡,然后用程控定量封口机(7.4)封口。观察 97 孔定量盘颜色,若出现类似或深于标准阳性比色盘(6.7)的颜色,则需排查样品、培养基、无菌水等一系列因素后,终止试验或重新操作。
注:9.1、9.2 步骤在野外操作时应避开明显局部污染源,建议使用一次性手套、口罩、酒精灯等。
9.3 培养
测定总大肠菌群和大肠埃希氏菌时,将封口后的 97 孔定量盘放入恒温培养箱(7.3)中37℃±1℃下培养 24 h。
测定粪大肠菌群时,将封口后的 97 孔定量盘放入的恒温培养箱中 44.5℃±0.5℃下培养24 h。
9.4 对照试验
9.4.1 空白对照
每次试验都要用无菌水(6.8)按照步骤 9.1~9.3 进行实验室空白测定。培养后的 97 孔定量盘不得有任何颜色反应,否则,该次样品测定结果无效,应查明原因后重新测定。
9.4.2 阴性和阳性对照
总大肠菌群、大肠埃希氏菌、粪大肠菌群的阴性、阳性菌株参考表 2。
表 2 阴性、阳性菌株参考表
检测指标 阳性菌种 阴性菌种
总大肠菌群
 
大肠埃希氏菌、
产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、
假单胞菌属(Pseudomonas sp.)
大肠埃希氏菌
 
大肠埃希氏菌
 
金黄色葡萄球菌、
假单胞菌属
粪大肠菌群 大肠埃希氏菌(耐热型)、
克雷伯氏菌属(Klebsiella trevisan)(耐热型)
产气肠杆菌、
粪链球菌(Streptococcus faecalis)、
假单胞菌属
 
将标准菌株制成 300~3000 个/ml 的菌悬液,将菌悬液按接种(9.2)和培养(9.3)要求
操作,阳性菌株应呈现阳性反应;阴性菌株呈现阴性反应,否则,该次样品测定结果无效,应重新测定。
注:可先制备较高浓度菌悬液,采用血球计数器在显微镜下对其浓度进行初步测定,然后根据实际情况用无菌水(6.8)稀释至 300~3000 个/ml。
9.4.3 结果判读与计数
将培养 24 h 后的 97 孔定量盘进行结果判读,样品变黄色判断为总大肠菌群或粪大肠菌群阳性;样品变黄色且在紫外灯(7.5)照射下有蓝色荧光,判断为大肠埃希氏菌阳性。如果结果可疑,可延长培养至 28 h 进行结果判读,超过 28 h 后出现的颜色反应不作为阳性结果。可使用保质期内的标准阳性比色盘以辅助判读,参见附录 A。
分别记录 97 孔定量盘中大孔和小孔的阳性孔数量。
10 结果计算与表示
10.1 结果计算
从 97 孔定量盘法 MPN 表(见附录 B)中查得每 100 ml 样品中总大肠菌群、粪大肠菌群数或大肠埃希氏菌的 MPN 值(置信区间参见附录 C)后,再根据样品不同的稀释度,按照公式(1)换算样品中总大肠菌群、粪大肠菌群数或大肠埃希氏菌浓度(MPN/L):
C=MPN值×1000/f(1)
式中:C——样品中总大肠菌群、粪大肠菌群数或大肠埃希氏菌浓度,MPN/L;
MPN 值——每 100 ml 样品中总大肠菌群、粪大肠菌群数或大肠埃希氏菌浓度,
MPN/100 ml;
1000——将 C 单位由 MPN/ ml 转换为 MPN/L;
f ——最大接种量,ml。
10.2 结果表示
测定结果保留两位有效数字,当测定结果≥100 MPN/L 时,以科学计数法表示;若 97
孔均为阴性,可报告为总大肠菌群、粪大肠菌群数或大肠埃希氏菌未检出或<10 MPN/L。
11 精密度和准确度
11.1 精密度
6 个实验室分别对低浓度(地下水,浓度均值为 6.0×10
2 MPN/L)、中浓度(地表水,
浓度均值为 4.0×10
4 MPN/L)和高浓度(生活污水,浓度均值为 9.0×107 MPN/L)三个不同浓度细菌总数的样品及有证标准样品(浓度为 2000 MPN/L)进行了 6 次重复测定:实验室内相对标准偏差范围分别为 0.26%~1.3%、0.65%~2.0%、1.3%~3.7%和 0.68%~2.8%;实验室间相对标准偏差分别为 9.9%、1.3%、4.2%和 1.3%;重复性限为 0.17、0.18、0.21 和 0.18;再现性限为 1.8、0.23、0.38 和 0.20;实验室间置信区间见表 3。
表 3 总大肠菌群实验室间 95%置信区间表
低浓度(MPN/L) 中浓度(MPN/L) 高浓度(MPN/L) 有证标准样品
均值 95%置信区间 均值 95%置信区间 均值 95%置信区间 均值 95%置信区间
6.4×102
 
5.5×102~7.4×10 4.0×104 3.5×104~4.6×104 4.1×106 3.7×106~4.6×106 1.4×103 1.8×10
3~2.3×103
 
3 6 个实验室分别对低浓度(地下水,浓度均值为 70 MPN/L)、中浓度(地表水,浓度均值为 9.0×10
3 MPN/L)和高浓度(生活污水,浓度均值为 2.0×10
6 MPN/L)三个不同浓度细菌总数的样品及有证标准样品(浓度为 2000 MPN/L)进行了 6 次重复测定:实验室内相对标准偏差范围分别为 0.69%~1.9%、0.93%~2.9%、5.4%~21%和 1.8%~3.0%;实验室间相对标准偏差分别为 9.6%、1.6%、15%和 3.7%;重复性限为 0.23、0.21、0.58 和 0.19;再现性限为 1.7、0.26、0.90 和 0.35;实验室间置信区间见表 4。
表 4 大肠埃希氏菌实验室间置信区间表
低浓度(MPN/L) 中浓度(MPN/L) 高浓度(MPN/L) 有证标准样品
均值 95%置信区间 均值 95%置信区间 均值 95%置信区间 均值 95%置信区间
59 39~90 8.5×103 7.3×103~9.9×103 1.5×106 1.3×106~1.7×106 7.7×102 1.7×103~2.3×103
 
 
3 6 个实验室分别对低浓度(地下水,浓度均值为 1.0×102 MPN/L)、中浓度(地表水,浓度均值为 1.3×104 MPN/L)和高浓度(生活污水,浓度均值为 3.0×106 MPN/L)三个不同浓度细菌总数的样品及有证标准样品(浓度为 3700 MPN/L)进行了 6 次重复测定:实验室内相对标准偏差范围分别为 0.40%~2.4%、1.3%~2.9%、3.4%~17%和 2.4%~9.2%;实验室间相对标准偏差分别为 8.9%、6.4%、6.6%、6.4%;重复性限为 0.22、0.26、0.58 和 0.55;再现性限为 1.6、0.76、0.64 和 0.75;实验室间置信区间见表 5。
表 5 粪大肠菌群实验室间置信区间表
低浓度(MPN/L) 中浓度(MPN/L) 高浓度(MPN/L) 有证标准样品
均值 95%置信区间 均值 95%置信区间 均值 95%置信区间 均值 95%置信区间
92 62~1.3×102 1.1×
104
9.5×103~1.4
×104
1.8×106 1.6×106~2.1×106 1.4×102 2.5×103~5.4×103
6 家实验室对总大肠菌群有证标准样品(2000 MPN/L)进行了 6 次重复测定:实验室内的相对误差范围为-6.4%~-3.5%;相对误差的最终值为-4.7%±1.2%。
6 家实验室对大肠埃希氏菌群标准样品(2000 MPN/L)进行了 6 次重复测定:实验室内的相对误差范围为-15%~-6.3%;相对误差的最终值为-13%±3.3%。
6 家实验室对粪大肠菌群的有证标准样品(3700 MPN/L)进行了 6 次重复测定:实验室内的相对误差范围为-17%~-0.81%;相对误差的最终值为-13%±6.1%。
注:微生物检测数据为偏态分布,其测定结果全部经以 10 为底对数转换后进行计算。
12 质量保证和质量控制
12.1 每批样品按对照试验(9.4)进行空白对照测定,定期使用有证标准菌株进行阳性和
阴性对照试验。
12.2 每 20 个样品或每批次样品(≤20 个/批)测定一个平行双样。
12.3 对每批次培养基须使用有证标准菌株进行培养基质量检验。
12.4 定期使用有证标准菌株/标准样品进行质量控制。
13 废物处理
实验中产生的废物经 121℃高压蒸汽灭菌 20 min 后,作为一般废物处理。

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